Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
2.6.19. ИСПЫТАНИЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПОЛИОМИЕЛИТА НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ
Обезьяны, используемые в испытании на нейровирулентность, должны соответствовать требованиям, приведенным в частной статье «Вакцина полиомиелита, пероральная (0215)» и иметь массу тела не менее 1,5 кг. Патогенность для обезьян семейств Macaca или Cercopithecus испытывается в сравнении с патогенностью стандартного вирусного препарата для испытания на нейровирулентность путем введения в поясничный отдел центральной нервной системы после седа-ции с использование подходящего агента, например, гидрохлорида кетамина. Для образца сыворотки, отобранного до инъекции, должно быть показано отсутствие нейтрализующих антител в разведении 1:4 при испытании против не более, чем 1000 CCID50 каждого из трех типов полиовируса.
Количество обезьян. Вакцину и подходящий гомотипический вирус сравнения испытывают одновременно в одной и той же группе обезьян. Вакцину и препарат сравнения вводят равному количеству животных. Животных с различающимися типами введенного препарата размещают случайным образом по клеткам, а их принадлежность кодируется таким образом, чтобы тип полученной ими прививки был скрыт от наблюдателей. Количество привитых обезьян должно быть таково, чтобы при оценке как вакцины, так и препарата сравнения было включено не менее одиннадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу типов 1 и 2, и не менее восемнадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу типа 3 (положительными считают обезьян, имеющих специфические нейронные повреждения, вызванные полиовирусом в центральной нервной системе). С одним и тем же гомотипическим стандартом могут испытываться несколько партий вакцины. По возможности, используют обезьян из одной и той же карантинной группы. В других случаях используют обезьян из двух групп, причем вакцина и препарат сравнения прививаются равному количеству обезьян из каждой группы. Если испытание проводится в течение двух рабочих дней, в каждый из дней вакциной и гомотипическим препаратом сравнения прививают равное количество обезьян.
Содержание вируса. Содержание вируса в вакцине и гомотипическом препарате сравнения регулируют таким образом, чтобы они были насколько возможно близки и находились в пределах от 1055 до 1065 CCID50 в 0,1 миллилитре.
Наблюдение. Всех обезьян наблюдают в течение 17-22 дней, отмечая признаки полиомиелита или других вирусных инфекций. Обезьян, выживших в течение первых 24 часов, но погибших до 11-го дня после прививки, подвергают вскрытию для определения того, являлся ли причиной гибели полиомиелит. Животные, погибшие по причинам, не связанным с полиомиелитом, не учитываются при оценке результатов. Умирающих и в тяжелой степени парализованных животных умерщвляют и вскрывают. Также вскрывают всех животных, выживших в течение периода наблюдения. Результаты испытания считают недостоверными, если более, чем у 20% животных в течение периода наблюдения была обнаружена интеркуррентная инфекция.
Количество срезов, подлежащих испытанию. Гистологическому исследованию подлежат, как минимум, поясничный и шейный отделы, верхний и нижний продолговатый мозг, средний мозг, зрительный бугор и двигательная область коры головного мозга каждой обезьяны. Отбирают препараты толщиной 15 мкм и окрашивают их галлоцианином. Минимальные количества подлежащих испытанию срезов составляют:
(a) 12 срезов, репрезентативных для поясничного утолщения,
(b) 10 срезов, репрезентативных для шейного утолщения,
(c) 2 среза продолговатого мозга,
(d) 1 срез моста и мозжечка,
(e) 1 срез среднего мозга,
(f) 1 срез с левой и правой части зрительного бугра,
(g) 1 срез с левой и правой части двигательной области коры головного мозга.
Подсчет вирусной активности. Для оценки вирусной активности в полу-секциях поясничного корда и ствола мозга используют систему подсчета тяжести повреждений, по которой следующим образом дифференцируют клеточную инфильтрацию и разрушение нейронов:
1. Наличие лишь клеточной инфильтрации (обезьяна не считается положительной),
2. Клеточная инфильтрация с минимальным повреждением нейронов,
3. Клеточная инфильтрация со значительным повреждением нейронов,
4. Массовое повреждение нейронов в сочетании или без клеточной инфильтрации.
Полученные значения записывают на стандартном бланке (пример подходящей формы имеется в разделе «Требования к вакцине полиомиелита (перо-ральной)» в Требованиях к биологическим субстанциям №7 Всемирной организации здравоохранения). Обезьяна, на срезах тканей которой имеются поврежденные нейроны, но не имеется игольчатых трактов, считается положительной. Обезьяна, на срезах тканей которой имеются игольчатые тракты, но не имеется поврежденных нейронов, не считается положительной. Срезы, на которых имеются повреждения травматического происхождения, но не имеется специфических вирусных повреждений, при подсчете не учитываются.
Уровни тяжести повреждений основаны на данных, полученных при изучении полусекций поясничных (L), шейных (C) и мозговых (B) гистологических срезов. Для каждой положительной обезьяны рассчитывают уровень повреждений (LS) по формуле
